根据已发表的鹅源副粘病毒NA-1株F基因序列,采用PCR体外定点突变技术,设计两对引物,引物中含有突变位点,应用重叠PCR延伸法三次PCR扩增F基因,使F蛋白第112位氨基酸密码子由AGG突变为GGA,第115位氨基酸密码子由AAA突变为GGA,第117位氨基酸密码子由TTT突变为ATT,从而得到突变后的F基因,命名为F’基因。将扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳、回收、纯化,将F’基因克隆进入PGEM-T载体,转化大肠杆菌DH5α,挑选白斑,经酶切及PCR鉴定,得到重组质粒PT-F’（含有NA-1株F’基因）。克隆的F’基因测序后,进行了序列分析。以软件DNASTAR、DNAMAN处理数据,分析结果。序列分析表明:扩增的F’基因片段的长度为1 662 bp,共编码553个氨基酸,F’蛋白112117位氨基酸的顺序为112 Gly-Arg-Gln-Gly-Arg-Leu117,与试验预计结果相符。用Bac to Bac表达系统表达改造后得到的鹅源副粘病毒NA-1株F’蛋白基因。首先将实验一得到的重组质粒pT-F’和转座载体pFastBacⅠ用限制性核酸内切酶EcoRⅠ和HindⅢ分别双酶切后,经琼脂糖凝胶电泳,回收纯化,得到F’基因和线性pFastBacⅠ。将酶切回收的线性pFastBacⅠ与F’基因用T4 DNA连接酶进行粘性末端连接,得到阳性重组质粒PFF’。PFF’转化大肠杆菌DH10Bac后,F’基因在助手质粒（helper plasmid）的帮助下,通过转座进入重组Bacmid质粒,构建了重组Bacmid质粒（re-Bacmid）。在含有X-gal/IPTG、庆大霉素、卡那霉素和四环素的琼脂平板上,筛选白色菌落后,提取re-Bacmid转染Sf-9昆虫细胞。在昆虫细胞内,re-Bacmid经复制、表达、装配,形成重组杆状病毒,并表达F’蛋白。经SDS-PAGE、Western-blot和间接免疫荧光鉴定,表达的F’蛋白的分子量为63KDa,并证明在昆虫细胞内表达的F’蛋白能部分糖基化,表达的F’蛋白约占细胞总蛋白的5%,说明经突变后的F蛋白具有较好的免疫原性和表达效率。
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