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植物无毒基因AvrRpt2表达、蛋白质纯化分析及结晶条件的探索

论文摘要

病原菌侵染宿主过程中，抑制宿主防御反应是极为关键的一步，病原菌借此得以在宿主内存活及繁殖。很好的一个例子就是假单胞耶尔森菌分泌的效应蛋白AvrRpt2对宿主“基因对基因”防御反应的抑制。效应蛋白AvrRpt2是一种蛋白酶，经三型信号分泌系统进入宿主后识别并酶切宿主蛋白RIN4。RIN4的降解使宿主抗病蛋白RPM1的防御反应，并无法检测假单胞耶尔森菌中另外的两种效应蛋白AvrB and AvrRpm1。效应蛋白AvrRpt2在病原菌内以酶原形式合成，以保护不对自身产生毒害，进入宿主后才被其分子伴侣活化。虽然AvrRpt2的遗传学和生物化学性状已经研究得较为透彻，对它活化以及催化底物的机制仍不清楚。为了对这些问题予以解答，我们目前致力于解决AvrRpt2的晶体结构以及其与ROC1、RIN4的复合物晶体结构。为获得AvrRpt2-ROC1复合物晶体，我们将AvrRpt2蛋白催化中心点突变，与ROC1混合后进行纯化。遗憾的是在凝胶层析的过程中，两者并没有形成稳定的复合物。这提示ROC1对AvrRpt2的活化作用可能是通过瞬时作用完成的或两者间作用微弱。对限制性蛋白酶切得到的蛋白及多种AvrRpt2蛋白质片段进行纯化的结果显示，AvrRpt2全长状态更易于结晶。尽管目前所获得的AvrRpt2蛋白质晶体大小还不足以进行数据收集，此蛋白质晶体结构的解析将为相关效应蛋白的晶体学研究提供有效的实验基础。

论文目录

  • 摘要
  • Abstract
  • 一 前言
  • 1 背景介绍
  • 1.1 植物三型分泌系统下抗病基因作用机制及其应用
  • 1.2 AvrRpt2的研究进展
  • 1.3 原核表达体系得应用
  • 1.4 蛋白纯化1蛋白纯化的影响因素
  • 1.5 蛋白质纯化与结晶的原理
  • 1.6 AvrRpt2的研究意义、内容、路线
  • 二 材料与方法
  • 2.1 材料
  • 2.2 方法
  • 三 结果与分析
  • 3
  • 3.1 重组子的酶切鉴定
  • 3.2 重组子的测序鉴定
  • 3.3 重组子的表达鉴定
  • 4 全长目的蛋白纯化图谱分析
  • 5 活性中心突变体及酶切位点突变体的纯化图谱分析
  • 5.1 活性中心突变体的纯化图谱分析
  • 5.2 纯化AvrRpt2& ROC1蛋白质混合物
  • 5.3 酶切位点突变体的纯化图谱分析
  • 6 全长蛋白酶切分析及质谱分析
  • 7 蛋白质晶体优化
  • 四 结论
  • 五讨论
  • 六 参考文献
  • 七 附录
  • 致谢

    • 相关论文文献

    本文来源: https://www.lw50.cn/article/bd21f450f6a30844cd908d81.html