目的:建立和评价一个新的多重PCR-反向线点杂交技术（mPCR/RLB）检测常见性传播疾病（STD）病原体的方法。方法:1.利用http://www.angis.org.au网站,在NCBI的GenBank数据库中获得试验菌株沙眼衣原体（CT）隐蔽质粒基因、淋病奈瑟菌（NG）的16S rRNA和Opa基因、3种支原体（人型支原体（Mh）,解脲脲原体（Uu）,微小脲原体（Up））的16S-23S rDNA间隔序列和6种念珠菌（白色念珠菌、热带念珠菌、克柔念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌、都柏林念珠菌）的5.8S-28S rDNA间隔序列的核苷核酸序列。分别设计CT和NG的特异性引物及检测探针。并用Pretty将6种念珠菌以及3种支原体的间隔序列分别进行比对,设计其相应属通用引物和各菌种的特异性寡核苷酸探针,使各引物及探针的Tm值等参数尽量一致。2.建立PCR/RLB检测6种常见念珠菌,对其进行方法学评价（包括特异性、敏感性等）,并与涂片法、培养法鉴定结果（Merieux Vitek）进行比较。3.建立mPCR/RLB同时检测CT、NG、Uu、Up和Mh等5种性病病原菌,并与荧光定量PCR（FQ-PCR）和支原体液体培养法进行比较。结果:1. PCR/RLB检测上述6种念珠菌的敏感性为10 CFU/ml。通过对100株念珠菌分离株的检测,与培养法（Merieux Vitek）比较表明,有97株与培养法鉴定结果一致,另外3株通过DNA测序证实与PCR/RLB检测结果一致。通过对200例女性阴道试子标本进行检测,PCR/RLB的阳性率为49%,而涂片法和培养法的阳性率分别为27%和39%,明显高于涂片法和培养法（P<0.05）。2. mPCR可同时扩增CT、NG、Uu、Up和Mh标准菌株DNA,其PCR产物的片段长度为208bp～414bp。97份FQ-PCR CT阳性标本中有93份经mPCR/RLB检测为CT阳性,45份FQ-PCR CT阴性标本中35份mPCR/RLB阴性。41份FQ-PCR NG阳性标本中34份mPCR/RLB NG阳性,101份FQ-PCR NG阴性标本中98份mPCR-RLB阴性。其中36份经mPCR/RLB检测为两重以上混合感染。32份支原体液体培养阳性标本中28份mPCR/RLB阳性,13份支原体培养阴性标本经mPCR/RLB检测均为阴性。结论:成功建立了Multiplex PCR/RLB快速、同时检测常见性传播疾病病原体的新方法,为其临床应用奠定了基础。
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