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东北白鹅和籽鹅抑制素α-亚基成熟区编码序列的克隆与原核表达

论文摘要

抑制素（INH）主要抑制垂体促性腺激素FSH的合成和分泌,从而抑制了禽类的排卵和产蛋。本实验对东北白鹅和籽鹅抑制素（INH）特异性的α-亚基成熟区cDNA的克隆及其在菌株BL21（DE3）中的原核表达进行探讨,旨在为开展表达产物对提高家禽繁殖率的应用提供理论依据。根据GenBank中鸡卵泡抑制素α-亚基序列设计引物,对该序列按大肠杆菌嗜好密码子进行优化,在设计的引物两端分别加上限制性内切酶SacI和XhoI的识别位点序列。利用RT-PCR技术从东北白鹅和籽鹅卵泡的颗粒细胞总RNA中扩增出抑制素α-亚基成熟区序列,经PCR扩增出354 bp片段,该片段与pMD18-T Simple载体连接,转化进XL1-Blue感受态细胞,所得阳性克隆进行双酶切鉴定和PCR鉴定,并进行了测序分析,得到的克隆序列与设计的序列基本一致。表明成功地获得了抑制素α-亚基编码序列的克隆载体。与NCBI发表的鸡的相应序列对比,东北白鹅和籽鹅核苷酸序列的同源性分别为94.44%和94.74%,其氨基酸序列的同源性分别为96.5%和97.35%,说明INH-α亚基的序列在禽类间具有高度保守性。从阳性细菌中提取质粒,经SacI和XhoI酶切,回收354 bp目的片段,应用T4DNA ligase连接到pET32a中,转化BL21（DE3）受体菌,提取质粒,成功筛选出阳性表达质粒。阳性菌经IPTG诱导,通过Trision-SDS-PAGE凝胶电泳,检测出东北白鹅和籽鹅卵泡抑制素α-亚基编码区的表达。将纯化的融合蛋白和凝血酶酶切后的单体蛋白主动免疫给小白鼠,经Western blotting检测,所制抗体可很清晰地检测到INH-α基因表达蛋白的特异带,由此证明INH-α亚基的融合蛋白和凝血酶酶切后的单体蛋白均有较好的免疫原性。

论文目录

  • 中文摘要
  • Abstract
  • 前言
  • （1） 东北白鹅
  • （2） 籽鹅
  • 第一章 文献综述
  • 1.1 抑制素的发现
  • 1.2 抑制素的来源
  • 1.3 抑制素的性质
  • 1.4 合成、分泌方式与转运途径
  • 1.5 抑制素分泌的调节
  • 1.6 抑制素的主要生理功能
  • 1.7 抑制素的分子克隆
  • 1.8 抑制素基因的表达及分子调节
  • 1.9 抑制素的免疫调节功能
  • 第二章 东北白鹅和籽鹅抑制素α-亚基的克隆和序列分析
  • 2.1 材料
  • 2.2 方法
  • 2.3 实验结果
  • 2.4 讨论
  • 2.5 小结
  • 第三章 抑制素α-亚基成熟区基因在大肠杆菌中的表达
  • 3.1 材料
  • 3.2 方法
  • 3.3 实验结果
  • 3.4 讨论
  • 3.5 小结
  • 第四章 融合蛋白的纯化及多克隆抗体的制备
  • 4.1 材料
  • 4.2 方法
  • 4.3 实验结果
  • 4.4 讨论
  • 4.5 小结
  • 第五章 结论及创新点
  • 参考文献（References）
  • 致谢
  • 附录
  • 个人简历

    • 相关论文文献

    本文来源: https://www.lw50.cn/article/e550cdfe3211a8b238777682.html