蓝藻是一类具有广泛适应性的光能自养型的原核生物,其所含营养丰富,是人类未来理想的食品;同时,蓝藻作为基因工程受体具有许多优点;但转基因产品中的标记基因的存在是多余的,甚至是有害的,因此要培育具有安全标记基因或者去除选择标记基因的转基因产物;而增强型绿色荧光蛋白（EGFP）被证明是一种安全标记基因,因此本研究以安全标记基因EGFP为标记基因,去除抗生素标记基因,并与流式细胞技术（FACS）相结合,开发无抗性标记的转基因蓝藻。本次研究的第一部分,设计引物用PCR技术扩增得到钝顶螺旋藻（Spirulina platensis）cpcB基因的上游启动片段PcpcB,将此片段插入载体pEGFP中的5’MCS中,成功构建pCEGFP质粒,经过多步亚克隆成功地1.2kb大小的PcpcB和EGFP片段,插入含有蓝藻内源小质粒pPbS的穿梭质粒pPKE2中,并去除了质粒上的抗性片段,利用多色分析和高速分选流式细胞仪（FACS Vantage SE）分选得到无抗性荧光菌,成功获得无抗性穿梭质粒pCGP,利用自然转化法将该质粒转化集胞藻Synechocystis sp.PCC6803,FACS Vantage SE分选转化成功的EGFP标记的集胞藻6803,通过荧光显微镜观察,成功获得EGFP标记的无抗性标记集胞藻Synechocystis sp.PCC6803。由于穿梭质粒在没有抗性压力下很容易丢失,因此在第二部分采用基因整合系统,选用更有经济价值且已规模化养殖的螺旋藻作为转化受体,进行无抗性转基因螺旋藻的研究。本研究的第二部分,将1.2kb大小的PcpcB和EGFP片段插入钝顶螺旋藻同源重组质粒pKRET4的EcoR I位点,成功构建EGFP标记的同源重组质粒pCGKT,将4.2kb大小的无抗性同源重组片段切下回收,该片段含有钝顶螺旋藻的同源片段R（recA基因）、PcpcB启动子、EGFP基因以及人源胸腺素Tα1表达盒,利用超声转化法尝试将该片段转入钝顶螺旋藻中,荧光显微镜观察,由于各种因素的影响,未能在显微镜下观测到转化成功的钝顶螺旋藻。本研究首次将EGFP基因和FACS技术相结合,构建无抗性穿梭质粒载体和同源重组质粒,分别以集胞藻6803和钝顶螺旋藻为转基因受体细胞,并首次在无抗生素选择压力下将EGFP基因转入集胞藻6803中,筛选以EGFP为标记的无抗性标记的转基因藻株,对无抗性转基因蓝藻的转化及筛选方法进行了初步探索,为进一步开发无抗性转基因蓝藻打下了一定的基础。
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