为了对犬瘟热病毒（CDV）R/20-8株N基因进行克隆与序列分析,进一步构建表达CDV N基因的原核表达载体以及探讨重组N蛋白检测CDV抗体间接ELISA方法,本研究采用分子生物学技术,将N基因克隆入pMD18-T载体,进行了N基因序列测定与分析;构建原核表达质粒pGEX-4T-1-N2,使之转化宿主菌BL21（DE3）和Rosetta,在IPTG的诱导下表达目的基因;以纯化的重组N蛋白作为包被抗原,辣根过氧化物酶（HRP）标记的兔抗犬IgG为二抗,对各种条件进行优化（如抗原的包被,作用时间及底物的选择） ,建立了检测犬瘟热（CDV）抗体的间接ELISA方法。序列比对结果表明CDV/R/20-8株属于弱毒谱系,与CDV流行株的亲源关系较远,N基因相对最为保守,其系统发生关系与H基因是一致的;表达载体pGEX-4T-1-N的表达量达菌体蛋白总量的22.52%。Western-blot分析表明所表达蛋白能与抗CDV阳性血清发生特异性的抗原-抗体反应;以重组N蛋白为包被抗原建立的ELISA方法,经检测筛选出最佳反应条件为:1 ug/孔纯化的CDV N蛋白包被酶标板,以10%兔血清进行封闭,酶标二抗最佳工作浓度的稀释比为1∶8000;以正常E.coli裂解上清液稀释待检血清,最佳血清稀释度为1:40。阻断试验和重复性等试验结果表明应用CDV N蛋白检测CDV抗体具有抗原纯度高,重复性好,特异性和灵敏度高等特点。
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