目的 分别构建两种突变人CD59的重组质粒,获得高效表达的CHO细胞真核表达系统,探讨突变CD59基因表达蛋白糖基化前后抗补体活性的变化,为在基因水平阐明糖尿病血管增殖症的发病机理奠定基础。 方法 将两种含不同突变基因的人CD59全长cDNA序列(HM7、HM8)的重组pALTER质粒转化大肠杆菌DH5α,氨苄青霉素筛选阳性克隆并扩增。重组质粒与pcDNA3质粒,按3:1比例,运用阳离子脂质体导入法共转染CHO细胞,用含有400μg/ml新霉素类似物(G418)的F12培养基培养13天筛选出阳性表达克隆,应用荧光免疫组化(FIH)、酶免疫组化(EIH)及流式细胞术(FACS)检测CD59在CHO细胞表面的表达。经染料释放试验检测突变CD59糖基化前后抗补体活性。 结果 构建了人突变CD59重组pALTER质粒,提取质粒酶切,琼脂糖凝胶电泳鉴定,观察到496bp的电泳条带,与所插入片段完全相符。运用阳离子质脂体导入法将重组pALTER质粒与pcDNA3质粒共转染CHO成功,筛选出的阳性克隆经FIH、EIH检测,证明突变CD59可在CHO细胞表达,流式细胞术测定表明HM7、HM8的表达率分别为36.6%、41.7%。用染料释放法证实两种突变CD59均具有抗补体活性,且在高糖环境下易糖基化,糖基化后抗补体活性明显降低。 结论 建立了两个高效表达突变CD59的真核表达系统,获得阳性克隆细胞株。初步研究证实突变CD59具有抗补体活性,糖基化后抗补体活性明显降低。本阶段研究为单克隆抗体的制备准备了条件,为在基因水平探讨糖尿病血管增殖症的发病机理奠定了基础。
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